持续20年的实验走到尽头
经过30,947次核移植尝试，并通过克隆培育出逾1,200只源自同一只雌鼠的小鼠后，日本研究团队结束了一项持续约20年的实验。第58代出生的5只小鼠次日全部死亡，这条研究人员曾认为可能无限延续的克隆链就此终止。
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这项实验从2005年持续到2025年，研究发现，反复克隆会让DNA中的有害变化不断累积。最初，出生成功率有所提高，从第一代的约7%升至第26代的15.5%。从第27代起，成功率开始下降，最终降至0.6%，相当于每1,000个移植到代孕母鼠体内的克隆胚胎中约有6只出生。
研究结果发表于《自然·通讯》的《连续克隆的局限性》。山梨大学在其研究公告中列出了参与研究的副教授若山沙也香，以及该校先进生物技术中心主任、教授若山照彦。
最能说明问题的是外表与繁殖能力之间的反差。这条克隆链上的许多小鼠看起来很健康，寿命也有约两年，但后代越来越难以繁殖，无论通过克隆还是普通交配都如此。
山梨大学小鼠克隆研究先驱若山照彦用一个常见的比喻，描述了这项实验背后的问题：
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这些小鼠的变化既涉及DNA的单个字母，也涉及大得多的染色体片段。研究将这些变化的累积与出生成功率最终崩溃联系起来。
研究人员如何克隆克隆鼠
研究团队采用体细胞核移植技术。体细胞是身体细胞，而非卵子或精子。研究人员取出含有细胞大部分遗传指令的细胞核，再将其移入一个已去除自身细胞核的未受精卵中。
随后，卵子必须重置这些遗传指令，使来自成年体细胞的细胞核能够引导胚胎发育。研究人员将形成的胚胎移植到代孕母鼠体内，再利用存活克隆鼠的细胞培育下一代。
供体细胞来自卵丘细胞，这种细胞围绕并支持卵子。最初的供体是一只雌性小鼠，拥有刺鼠色毛皮。这种毛色由单根毛发上的色素带形成。所有克隆小鼠都是雌性，也都具有这种毛色。
研究人员每年培育约三至四代。他们并非每次都直接使用原始供体保存的细胞来培育小鼠，而是不断通过新克隆出的动物传递这一血统。这样的设计使他们能够追踪从一代传到下一代的变化。
为何早期结果看起来令人鼓舞
理化学研究所（RIKEN）在2013年3月的公告中称，实验当时仍在朝着令人鼓舞的方向发展。截至论文提交时，研究团队已培育出25代、共581只小鼠；到公告发布时，则已达到26代、共598只。
研究人员使用了曲古抑菌素A（TSA），这是一种有助于移植细胞核重置基因活性的药物。此前，反复克隆小鼠的尝试最多只延续约六代。使用TSA并改进实验条件后，出生成功率不再持续下降，反而有所上升。
当时，对健康状况、生育能力、寿命以及染色体末端的测量结果也令人安心。因此，研究人员认为这一过程或许可以无限延续。此后又追踪同一血统十年，才显现出头25代中尚未察觉的问题。
主要里程碑显示了研究结论如何变化：
- 2005年：连续克隆开始。最终论文将起始时间定为1月，而RIKEN在2013年的报道则称实验于当年晚些时候开始。
- 2013年3月8日：RIKEN宣布，已培育出26代、共598只小鼠，出生成功率达到约15%。
- 第27代起：尽管各代之间有所波动，出生成功率仍开始持续下降。
- 2025年：实验在第58代结束，该代出生的5只小鼠次日全部死亡。
DNA内部发生了什么变化？
基因组测序发现，从第一代到第57代之间出现了约3,700个单核苷酸变异和80个小型插入或缺失。单核苷酸变异（SNV）是DNA序列中一个字母发生变化。插入或缺失则是指在该序列中增加或移除一小段内容。
论文计算得出，每代平均出现69.4个SNV和1.4个小型插入或缺失。许多DNA变化影响很小，但有些会干扰正常发育或繁殖所需的遗传指令。
作为比较，研究人员检查了两个通过连续60代同胞交配、维持约20年的小鼠品系。这些品系每代平均累积22.3个SNV。因此，克隆血统的变异率约为其3.1倍，即69.4个对比22.3个。
研究预测会破坏或改变蛋白质的少数变异所占比例也有所上升。从第一代至第23代期间出现的变异中，这一比例为0.52%；在第23代至第57代期间出现的变异中，则升至1.19%。
研究人员还根据小鼠DNA重建了它们的家谱。结果与实验记录的血统一致，证实这条克隆链在整个实验期间始终源自最初的供体。
更大规模的染色体变化加重影响
这些小鼠累积的变化不只涉及单个DNA字母。测序发现，从第一代到第57代之间出现了约80至84个新的结构变异，即DNA排列方式或数量发生较大改变。
其中16个大型变异涉及至少40,000个DNA字母的片段。这些变化包括一条X染色体缺失、四号染色体上的重大改变，以及七号与九号染色体之间的物质交换。
研究人员估计，到第57代时，即使不计一条X染色体的缺失，也已有约30个突变导致基因功能丧失，约50个突变改变了基因编码的蛋白质指令。另有两个大型缺失影响同一区域，导致名为Csmd1的基因两份拷贝均失去功能。
作者将出生率下降归因于突变的综合负担。他们的解释是，实验末期出现的更多有害变化，使原本已经发生大量改变的基因组超出了发育中的小鼠所能承受的范围。
变异率为何较高，目前仍无定论。反复移植体细胞核可能是原因之一，体细胞也可能在动物一生中不断积累突变。此外，缺乏正常的有性生殖也会改变突变在世代间的传递方式。
重置基因活性为何仍不够
克隆不只是将DNA移入卵子。卵子还必须重置有助于决定哪些基因处于活跃状态的化学标记。这些标记称为表观遗传标记，因为它们调控DNA的使用方式，却不改变其序列。
研究人员曾怀疑，这种重置过程的失败可能会随着每轮克隆而加剧。但他们的测量结果显示，后期出生率下降的主要原因似乎是DNA突变不断累积。
克隆小鼠的胎盘较大，这是小鼠克隆的一种已知特征。整个实验期间，克隆鼠胎盘平均重约0.30克，而对照组通过体外受精培育的小鼠胎盘重0.11克。不过，胎盘重量并未随着克隆代数增加而持续上升。
对早期胚胎若干表观遗传标记的检测也显示，新培育的克隆鼠与第51代克隆鼠的整体模式大体相似。TSA仍有帮助：第51代使用TSA处理后的出生成功率为5.4%，未处理时则为1.6%。
端粒，即染色体末端的保护性DNA序列，是另一种可能的解释。后期测序分析并未发现有力证据，表明在所研究的各代之间端粒显著缩短。综合各项检测结果，研究人员将注意力转向不断增加的DNA序列和染色体结构变化。
看起来健康的小鼠，后代却越来越少
普通交配揭示了从小鼠外表难以察觉的繁殖能力下降。第20代雌鼠与普通雄鼠交配时，平均每胎产下9.9只幼鼠，与对照组的10.3只相近。
此后，平均每胎幼鼠数降至第50代的2.8只和第55代的2.2只。后者比对照组平均值低约79%，计算依据是每胎2.2只对比10.3只。
随着克隆代数增加，激素刺激后采集到的卵子数量并未减少。因此，研究人员进一步考察了卵子在激活或受精后会发生什么。
在实验室中用普通雄鼠的精子给卵子受精后，97.6%的对照组胚胎发育到囊胚期，即着床前的早期阶段。第25代克隆鼠卵子的这一比例为39.7%，第53代则为20.3%。
使用第56代卵子的实验发现，细胞核和细胞质都存在问题，后者是包围细胞核的物质。即使分别将其中任一部分替换为对照组卵子的相应部分，发育率仍然很低。卵子的两部分似乎都受到了损害。
有性生殖使部分繁殖能力恢复
部分来自后期克隆鼠的后代存活下来，繁殖能力也更强。第55代克隆雌鼠平均每胎产下2.2只幼鼠，而其后代后来平均每胎产下7.0只，超过前者的三倍。
这些后代的胎盘大小也接近受精胚胎发育形成的胎盘，而非克隆小鼠常见的增大胎盘。
有性生殖会在卵子和精子形成时重新组合遗传物质，并在受精时将其与另一亲本的DNA结合。一个亲本提供的正常基因拷贝有时可以弥补另一个亲本的受损拷贝。遗传问题严重的胚胎可能停止发育，而遗传组合尚可的胚胎则会存活下来。
这些后代仍从克隆雌鼠那里遗传了突变。基因组测序在子代和孙代中都发现了变异，包括七号和九号染色体之间的交换。研究人员推测，两条发生改变的染色体是一起遗传的，因此交换后的遗传物质仍保持平衡。
因此，窝仔数的改善表明，有性生殖使繁殖能力部分恢复。后代的繁殖能力有所提升，但仍携带克隆过程中累积的部分遗传变化。
这对保护工作与畜牧业意味着什么
克隆受到保护工作者关注，因为保存的细胞可以留存已死亡或无法繁殖动物的遗传物质。在畜牧业中，克隆提供了一种繁育具有优良性状动物的方法。这项实验表明，这些用途都需要关注供体DNA的状况以及后代的繁殖健康。
这项研究考察的是通过一长串连续供体反复克隆的情况。在这些实验条件下，第58代是这条特定小鼠血统达到的终点；其他血统或哺乳动物物种能够延续多少代，尚不得而知。
加州大学戴维斯分校发育内分泌学家卡塔日娜·马林并未参与这项研究。她表示，研究结果支持通过保护工作避免物种陷入危机，而非等到危机发生后再依赖克隆进行拯救。
保护组织Revive & Restore的本·诺瓦克强调了动物一生中在体细胞组织内累积突变这一发现的意义。供体细胞携带着自身累积的DNA变化，这一点很重要，因为该细胞会成为培育另一只动物的起点。
这项研究总结出两点实际启示。克隆可以让动物的遗传物质在许多代中得以延续，但要维持健康的后代，也取决于这些DNA随时间发生了什么变化。在这项实验中，克隆链走到尽头前，有性生殖使部分后代恢复了繁殖能力。
要点
- 研究人员进行了30,947次核移植尝试，通过连续克隆，从一只原始雌鼠培育出逾1,200只小鼠。
- 出生成功率在第26代达到峰值15.5%，随后下降至实验末期的0.6%。
- 第58代出生的5只小鼠次日全部死亡，克隆链于2025年终止。
- 与通过同胞交配维持的对照品系相比，克隆血统每代累积的单个DNA字母变化约为其三倍。
- 有害DNA突变和大型染色体变化不断累积，而测得的表观遗传异常并未逐步加重。
- 有性生殖提高了部分后代的繁殖能力，但遗传突变仍然存在。
