第58代的崩溃
经过二十年的持续实验，日本科学家在无限克隆哺乳动物的探索中撞上了生物学壁垒。在一项从2005年持续到2025年的研究中，山梨大学的研究人员以一只雌性供体小鼠为源头，成功培育出1200多只克隆小鼠，连续复制了57代。然而，当他们尝试培育第58代时，所有新生小鼠都在出生后一天内死亡，这首次以实证表明，哺乳动物无法仅靠克隆延续种群。
这项研究发表在《自然·通讯》上，为哺乳动物的连续克隆设定了明确上限，也推翻了此前的假设：只要操作足够谨慎，这一过程就能无限持续。资深作者、将毕生精力投入克隆研究的发育生物学家若山照彦对结果表示失望。
我们原以为可以培育出无限多代克隆体。因此，这些结果令人非常失望。目前，我们还没有办法突破这一限制。
研究人员将这一现象称为“突变崩溃”。它印证了一项有百年历史的进化理论——穆勒棘轮效应。该理论预测，无性繁殖会不可避免地累积有害突变，直至某个谱系无法存续。植物和一些低等动物能够进行克隆繁殖，似乎不受此限；但哺乳动物在生物学上似乎无法摆脱这一遗传陷阱。
历时二十年的遗传马拉松
实验始于2005年1月。若山团队采用体细胞核移植技术，以一只棕色毛发的雌性供体小鼠培育出第一代克隆体。这项技术是从供体细胞（本例中为滋养卵子发育的卵丘细胞）中取出细胞核，再将其植入已移除原有细胞核的未受精卵中。1996年诞生的多莉羊和1998年诞生的首只克隆小鼠坎穆莉娜，都是通过同样的方法培育出来的。
最初的克隆体长到三个月后，研究人员对其进行克隆，再克隆新一代克隆体，每三到四个月重复一次这一过程。此后所有克隆体均为雌性，毛色也都与原始供体一样呈棕色。整个实验中，团队严格控制条件，由同两名研究人员负责各代的细胞核移植，以尽可能减少变量。
前25代的结果相当令人鼓舞。成功率实际上有所提高，从早期实验的7%升至第26代的15.5%。小鼠没有明显的身体异常，寿命约为两年，与正常小鼠相当；与正常雄鼠交配后，也能生育健康后代。2013年，若山团队发表初步研究结果，认为连续克隆很可能可以无限延续。
不过，研究团队在最初的研究中并未进行深入的基因测序。此后，他们又将实验持续了13年，分析不同代次克隆体的基因组，发现突变不断累积的趋势令人担忧，而这一趋势最终将使该谱系走向终结。
复印件的问题
研究人员分析了第6代至第57代中10只克隆小鼠的全基因组序列，在该谱系中发现约3700个单核苷酸变异和80个插入缺失突变。平均每一代都会在遗传密码中新增69.4个单核苷酸变异和1.4个结构变异。在某些情况下，这些突变率与自然突变率相当，但关键区别在于，这些错误会如何随时间累积。
研究人员把这一过程比作反复复印一张图像。第一份复印件看起来几乎与原件相同，但会带有细微瑕疵。再复印这份复印件，瑕疵就会层层叠加。经过几十次复制，图像会与原件相去甚远。从生物学角度看，如果没有有性生殖过程中发生的遗传重组，有害突变便没有机会从这一谱系中清除。
到第27代时，开始出现大规模结构异常，包括染色体易位和杂合性缺失。几只小鼠失去了整条X染色体，而这一缺陷在后续代次中越来越常见。这些结构变异尤其危险，因为与简单的点突变相比，它们影响的基因组范围更大。
与自然交配繁殖的小鼠相比，克隆小鼠的突变负担增加了三倍。到第57代时，存活率骤降至0.6%；尽管出生的小鼠外表看起来健康，却携带致命的遗传损伤，并在第58代显现出致死后果。
有性生殖为何重要
这项研究有力地说明，哺乳动物为何进化出了有性生殖，而非无性克隆。研究人员将第20代、第50代和第55代的雌性克隆体与正常雄鼠交配，发现结果差异显著。第20代克隆体每胎平均产仔9.9只，与自然繁殖的小鼠相当；第50代克隆体每胎平均产仔数仅为2.8只，第55代则只有2.2只。
更重要的是，当这些后代，也就是原始克隆体的孙代，继续繁育时，每胎产仔数回升至7.0只，基因分析也显示其基因组恢复正常。有性生殖通过染色体重组和自然选择，有效筛除了累积的突变。
若山简明解释了这一机制：
在克隆过程中，所有基因都会传给下一代，这意味着所有缺陷基因也会一并传下去。由于这些突变会持续累积，哺乳动物无法通过克隆延续种群。
这一发现支持穆勒棘轮效应。这一理论模型由遗传学家赫尔曼·约瑟夫·穆勒于1932年提出，预测无性繁殖的谱系会不可避免地累积有害突变，直至发生“突变崩溃”并灭绝。细菌和一些简单动物可以通过其他机制清除突变；而哺乳动物似乎依赖有性生殖带来的遗传重组，才能维持几代之后的基因组完整性。
技术局限与生物现实
整个实验期间，研究人员使用了曲古抑菌素A（TSA），这是一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂，可通过放松DNA的蛋白质包装来促进细胞核重编程，使基因在胚胎发育早期正常激活。这种化学处理对早期实验的成功至关重要，最高可使克隆效率达到标准方法的六倍。
即使到了第50代，TSA仍然有效：经处理的细胞核移植成功率为5.4%，而未处理时仅为1.6%。这表明，后期代次的失败并非源于表观遗传异常（即基因表达方式出错），而是DNA序列本身存在固有的基因突变。
分析发现，后期代次克隆体的卵母细胞（卵细胞）在细胞核和细胞质中均已受损。研究人员将第56代克隆体卵细胞的细胞核替换为健康遗传物质，或在保留克隆体细胞核的同时替换细胞质，这两种组合都导致发育结果不佳，说明细胞已遭受全面损伤。
尽管背负着这些遗传负担，大多数活到出生的后期代次克隆体外表仍然健康，寿命正常，也没有明显的身体异常。它们的胎盘异常偏大，但功能正常。这种韧性表明，哺乳动物在个体层面上对遗传变异的耐受程度出人意料；但随着突变不断累积，克隆最终仍无法继续。
对保护工作与产业的影响
这项研究使一些曾引发公众想象、并获得研究经费支持的克隆技术设想面临重大质疑。保护生物学家曾希望通过克隆保存下来的细胞，培育基因相同的备用种群，以挽救濒危物种。农业研究人员也曾设想大规模培育优质牲畜，例如和牛，以降低高档牛肉的价格。
研究显示，这些应用面临根本性的生物学限制。克隆单只动物仍然可行，但通过连续克隆建立能够自我维持的哺乳动物种群，似乎并不可能。即使是将遗传资源保存在冷冻“种子库”中，以便在末日之后恢复物种，也需要通过有性生殖清除累积的突变，而不能只靠克隆保存下来的细胞。
这项研究也让有关克隆人军团的科幻设想失去了现实基础。若山幽默地指出，这些发现意味着《星球大战》前传《克隆人的进攻》中描绘的克隆人士兵不可能被培育出来。收费数千美元克隆已故猫狗的高端宠物克隆行业，也面临着关于克隆动物遗传一致性的问题。
研究人员强调，克隆体并不是原始供体的完美复制品。在这项研究之前，即便一些科学家也一直存在这一误解。每只克隆体都带有独特的突变，因此在遗传上与原始供体以及其他克隆同胞有所不同。
寻找解决办法
若山承认，现有技术无法解决突变累积问题。
他说道，但没有提出具体的创新路线图。我认为，我们需要开发一种从根本上改进细胞核移植技术的新方法，
一种替代方案或许是定期让克隆谱系恢复有性生殖，以清除突变负担后再继续克隆；但这违背了维持纯遗传谱系的初衷。理论上，基因编辑技术可以在突变累积前将其修正，但要从数千种累积变异中找出有害变异，仍然面临技术挑战。
这项研究耗时之久，使其短期内难以重现。研究人员在20年间进行了3万多次细胞核移植，所需的资源和耐心鲜有实验室能够承担。如今，欧洲的动物研究法规很可能不允许进行如此漫长的实验，因此这套独特的数据集或许多年内都难以被新研究超越。
要点
- 日本研究人员历时20年连续克隆小鼠58代，以一只供体小鼠为源头培育出1206只小鼠。
- 第58代的所有克隆体都在出生后一天内死亡，首次以实证确立了哺乳动物连续克隆的极限。
- 基因突变累积速度是自然繁殖的三倍，其中包括X染色体丢失和大规模DNA结构变异。
- 研究结果印证了穆勒棘轮效应理论，表明无性繁殖会不可避免地导致哺乳动物发生“突变崩溃”。
- 后期代次克隆体与正常雄鼠交配后，突变累积得以逆转，产生了健康的孙代。
- 濒危物种救助、大规模牲畜生产和宠物克隆等应用，都受到这些遗传限制带来的根本性生物学约束。
- 研究人员总结称，与植物和低等动物不同，哺乳动物无法仅靠克隆无限期地延续种群。
